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用户文章 IF=9.685|m5C bis-seq助力NSUN2的致癌活性机制研究

作者：上海云序生物科技有限公司 2023-01-04T10:57 (访问量:6582)

5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA甲基转移酶NSUN2参与了细胞增殖和转移形成的调控，并在多种癌症中表达上调。然而，NSUN2在胃癌（GC）中的生物学意义以及NSUN2本身的修饰尚未得到充分的研究。2021年8月9日，云序客户温州医科大学第二附属医院卢明东团队在Cell Death Dis（IF=9.685）上发表文章“NSUN2 modifified by SUMO-2/3 promotes gastric cancer progression and regulates mRNA m5C methylation”。该研究发现，NSUN2在胃癌中表达上调，是胃癌预后不良的预测因子。揭示了NSUN2在GC进展中发挥作用的新机制，为胃癌患者提供新的治疗选择。云序生物有幸参与了此项研究中的m5C bis-seq高通量测序技术服务。

发表期刊：Cell Death Dis
影响因子：9.685
发表时间：2021年8月9日
研究方法：m5C bis-seq、CO-IP、qRT-PCR
文章链接：NSUN2 modified by SUMO-2/3 promotes gastric cancer progression and regulates mRNA m5C methylation

技术路线

研究内容

1.GC中m5C调控因子的表达景观及临床相关性
为了评估m5C调控因子在GC中的表达谱，作者从TCGA胃腺癌（STAD）项目中提取了与m5C相关的基因测序数据。在热图中展示了基因的整体表达水平（图1A）。与对照组相比，m5C调节因子在GC样品中普遍高表达，并且通过m5C调节网络描述了它们的相互作用和对胃癌患者总生存率的影响（图1B）。结果表明，NSUN2与其他m5C调控因子密切相关，且m5C调控因子的整体表达水平与患者的总生存率显著相关。

2.NSUN2在胃癌中高表达，并与不良预后相关
根据TCGA数据，作者发现NSUN2在多种癌症中均过表达（图1C）。为了进一步研究NSUN2的表达模式和胃癌患者的临床意义，作者用GC组织芯片对NSUN2进行了IHC染色，IHC结果显示，NSUN2主要在癌细胞的细胞核中表达，部分在细胞质中表达（图1D）。NSUN2在肿瘤组织中的表达高于在邻近正常组织中的肿瘤组织（图1E-F）。此外，Kaplan-Meier生存分析结果也表明，NSUN2高表达的胃癌患者总生存期（OS）低于NSUN2低表达的胃癌患者（图1G）。

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图1.RNAm5C调控因子在胃癌（GC）和NSUN2中的表达景观及临床相关性

3.NSUN2可促进胃癌细胞的增殖和转移
为了研究NSUN2在GC细胞中的致瘤作用，作者用siRNA敲除BGC-823和SGC- 7901细胞中的NSUN2。通过免疫印迹法检测，发现NSUN2的表达显著降低（图2A）。之后，为了确定NSUN2对GC细胞增殖的调控作用，作者进行了CCK-8和5-乙基-2’-脱氧尿苷（EdU）检测，发现NSUN2的下调导致BGC-823和SGC-7901细胞的增殖率下降（图2B、D）。与对照组相比，NSUN2过表达导致细胞增殖率显著增加（图2E-I）。采用集落形成试验来确定NUSN2对GC细胞增殖的长期影响。结果发现，两周后，NSUN2敲除组形成的菌落较少，而与对照组相比，NSUN2过表达组形成的菌落数量有所增加（图2C、H）。综上所述，NSUN2可促进GC细胞的增殖。

为了进一步探索NSUN2在GC进展中的作用，作者在BGC-823和SGC-7901细胞中进行了NSUN2敲低和过表达的迁移和侵袭实验。结果显示，与si-NC组相比，转染了si-NSUN2的GC细胞的迁移和入侵细胞数量显著减少（图3A-B），与对照组相比，过表达NSUN2的GC细胞的迁移和侵袭能力有所增加（图3C-D）。

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图2 NSUN2促进人胃癌（GC）细胞的生长

图3 NSUN2促进胃癌（GC）细胞的迁移和侵袭

4.SUMO-2/3调节NSUN2的蛋白稳定性和亚细胞定位
为了探讨NSUN2促进GC的分子机制，作者通过进行免疫共沉淀（CO-IP）和质谱分析，研究了蛋白与NSUN2相互作用。CO-IP结果显示，SUMO-2/3被NSUN2-HA拉下，表现出直接的相互作用（图4A），并且还发现了两个SUMO相互作用基序（SIMs）和五个SUMOylation共识位点（图4B）。之后，通过两个突变质粒的构建，作者将NSUN2- HA、Δ236-240aa和Δ497-711aa转染到BGC-823细胞中，并进行CO-IP检测。发现转染NSUN2-Δ236-240aa后，NSUN2与SUMO-2/3之间的相互作用几乎消失，而转染NSUN2-Δ497-711aa后的相互作用略有下降（图4C）。此外，为了探讨NSUN2的SUMO化修饰是否影响蛋白水平。作者将抗SUMO-2/3的si-rna转染到BGC-823细胞中，并通过蛋白印迹法检测NSUN2蛋白水平，结果表明在SUMO-2/3基因敲除后，NSUN2的总蛋白水平几乎没有下降（图4D）。为了研究SUMO化修饰是否能改变NSUN2的亚细胞定位，作者转染了NSUN2-HA质粒，发现过表达NSUN2导致NSUN2在细胞质和细胞核中的表达显著增加(图4E）。将NSUN2-HA和SUMO-2/3si-RNAs共转染到细胞中，并分离出细胞质和核蛋白。结果显示在SUMO-2/3基因敲低后，NSUN2蛋白在细胞质中的水平略有下降，而在细胞核中的水平显著下降(图4F）。对NSUN2敲除的MGC-803（图4G）和BGC-823进行免疫荧光（IF）检测。检测NSUN2-HA和si-SUMO-3-2转染后NSUN2的亚细胞分布，结果表明SUMO-2/3基因敲低抑制了NSUN2向细胞核的易位。

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图4 SUMO-2/3与NSUN2相互作用，保持其稳定性，促进其核易位

5.NSUN2通过m5C依赖和独立机制促进胃进展
为了确定NSUN2的致癌功能是否依赖于其m5C甲基转移酶活性，作者通过引入释放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位点的点突变，生成了NSUN2的两个酶死亡突变体（图5A）。通过过表达NSUN2野生型和突变质粒BGC-823NSUN2-prhinty细胞系，发现NSUN2的野生型和酶死突变体能够部分拯救GC细胞的增殖和转移的能力，和野生型NSUN2呈现更重要的功能(图5B-C），这些结果表明，NSUN2通过m5C依赖和独立的机制促进胃进展。为了探索NSUN2依赖于m5C的功能，作者用m5C Bis-Seq获得了GC细胞中NSUN2敲除后转录组范围内的m5C修饰。对WT在NSUN2敲除细胞中分别鉴定出3260和712个m5C峰和135和70个独特基因（图5D），证实了真核mRNA中的m5C修饰主要是由NSUN2催化的。并且根据RNA转录本中m5C峰的定位，将其分为5’UTR区、StartC、编码序列（CDS）、StopC和3’UTR（图5E），其中m5C位点位于CG富集区中（图5F）。KEGG分析显示，NSUN2介导的m5C修饰基因在多种癌症相关信号通路中显著富集，如Rap1信号通路、铂类耐药性和细胞周期过程的调控等（图5G）。这些数据表明，NSUN2介导的GC转录本中的m5C修饰与RNA代谢和癌症发展密切相关。

此外，作者还研究了m5C峰的变化是否会影响mRNA的表达水平。通过筛选了NSUN2-KO BGC- 823细胞中下调基因下降的m5C峰，鉴定了NSUN2的6个候选靶点，包括CCDC85B、SHOC2、PCYT1A、MT-ND4、SREK1和PIK3R1（图6A）。共表达热图显示，NSUN2的表达与除CCDC85B外的所有这些基因均密切相关（图6B）。之后qRT-PCR证实了NSUN2基因敲除后，PIK3R1和PCYT1A的表达水平显著降低，因此，作者推测PIK3R1和PCYT1A可能是NSUN2修饰的m5C的靶基因。综上，NSUN2介导的m5C修饰影响了GC的形成。

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图5 NSUN2的致癌性部分依赖于m5C的修饰

图6 NSUN2潜在的m5C修饰候选基因可直接靶向基因

总结

本研究通过m5C bis-seq分析，证实了NSUN2在胃癌中表达上调并与不良预后相关，并通过测定了m5C在GC mRNA中的分布，发现m5C修饰的基因主要参与了多种癌症相关的信号通路，SUMO化修饰-NSUN2-m5C轴可能是胃癌和泛癌治疗的一个新的诊断和治疗靶点（图7 ）。

图7 SUMO-2/3-NSUN2-m5C修饰在胃癌中的功能景观模型

云序生物m5C甲基化研究五大模块

01 m5CRNA甲基化测序
m5C RNA甲基化测序（m5C-seq）
对m5C RNA甲基化，目前最流行的检测手段为m5C-Seq技术，适用于m5C RNA甲基化谱研究，快速筛选m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m5C测序：

m5C 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
m5C LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
m5C Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
m5C mRNA测序

02 检测整体m5CRNA甲基化水平

LC-MS/MS检测整体RNA甲基化水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
03 m5CRNA甲基化上游酶的筛选
m5C RNA甲基化相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m5C RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m5CRNA甲基化靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3 双荧光素酶实验

验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。

5.4 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

云序生物服务优势

优势一：云序累计支持客户发表 100 + 篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子 960 +
优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：可检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：提供m5C一站式服务：m5C整体水平检测、m5C-seq、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。