组蛋白巴豆酰化（histone crotonylation, Kcr）是一种新型的组蛋白翻译后修饰（PTM），首次发现于2011年。与乙酰化（acetylation, Kac）相比，Kcr不仅在调控基因表达上具有独特作用，还可能参与细胞代谢状态感知，因此在表观遗传学和代谢组学交叉研究中越来越受到关注。在分析组蛋白巴豆酰化时，常用质谱（MS）结合免疫富集的方法，以实现高灵敏度和特异性检测。

一、样本准备

1、样本类型

• 细胞株：如HEK293、Hela等，可进行处理实验。
• 组织样本：新鲜或冷冻组织，需避免蛋白降解和去修饰。
• 培养条件：巴豆酸或丁酸处理可增强巴豆酰化信号，便于检测。

2、核蛋白提取

巴豆酰化主要存在于组蛋白上，核蛋白富集是关键步骤：

• 细胞裂解 → 获取核沉淀。
• 使用高盐或酸性提取组蛋白。
• 蛋白定量后，进行后续酶切或免疫富集。

组蛋白含有大量赖氨酸残基，巴豆酰化通过添加一个4碳的羧酸链修饰赖氨酸，使得组蛋白带负电荷，影响染色质结构与转录活性。

二、蛋白消化策略

质谱分析前需将蛋白切成可分析的肽段：

1、酶切选择

• 胰蛋白酶（Trypsin）：常用，但Kcr修饰可能阻碍赖氨酸切割。
• Lys-C：对修饰赖氨酸更友好，可减少漏切。

2、消化优化

• 可以联合酶切（Lys-C + Trypsin）提高覆盖率。
• 保证pH和温度条件适宜，防止Kcr水解。

巴豆酰化相对乙酰化稳定性稍高，但仍需避免高温和强酸过度处理。

三、修饰肽富集

由于巴豆酰化在组蛋白中占比低，直接MS检测灵敏度有限，需要特异性富集：

1、免疫富集

• 使用高特异性抗-Kcr抗体。
• 结合磁珠或琼脂糖珠进行肽段富集。

2、选择性化学捕获（较少用）

• 一些方法使用化学标签与Kcr反应，提高质谱检测效率。

免疫富集相当于在“海量肽”中用“磁铁”抓取特定“带巴豆链的肽”，极大提高检测灵敏度。

四、LC-MS/MS 检测

1、仪器选择

• 高分辨质谱：Orbitrap 或 Q-Exactive 系列最常用。
• 液相色谱（LC）：纳升级反相色谱（nano-RP-LC）可提高分离能力，减少复杂背景干扰。

2、数据采集模式

（1）DDA（Data Dependent Acquisition）

• 常用于发现性分析。
• 依赖强度选择肽段碎片。

（2）DIA（Data Independent Acquisition）

• 可提高重复性和覆盖率。
• 对定量研究尤其有用。

3、MS参数优化

• 分辨率 ≥ 60,000（MS1），碎片化能量需优化（HCD常用）。
• 对巴豆酰化修饰应设置动态修饰 + 42.0106 Da（巴豆酰基质量）。

巴豆酰化肽的质谱信号比乙酰化肽稍微弱，优化碎片化能量可以显著提高识别率。

五、数据分析

1、软件工具

• MaxQuant / Proteome Discoverer：支持Kcr标记搜索。
• Spectronaut 或 DIA-NN：适合DIA数据处理。

2、分析重点

• 修饰位点定位（确保高概率定位）。
• 蛋白-修饰肽定量（LFQ或TMT标记）。
• 差异分析：比较处理 vs 对照组，识别显著上调/下调Kcr位点。

3、生物学解读

• 富集的通路分析（如KEGG、GO）。
• 与转录调控或代谢状态相关联。
• 可结合其他组学数据（乙酰化、甲基化、代谢组）多维度解读。

六、百泰派克生物科技的技术优势

在实际应用中，百泰派克生物科技提供全流程Kcr分析服务，包括：

• 高覆盖组蛋白修饰谱：Orbitrap质谱 + 优化免疫富集。
• 多样本定量比较：支持TMT或LFQ定量。
• 个性化报告：整合KEGG/GO富集及可视化热图。

组蛋白巴豆酰化（Kcr）分析通常包括样本准备、组蛋白提取、酶切、修饰肽富集、质谱检测和数据分析几个关键步骤。首先，从细胞或组织中快速提取核蛋白并纯化组蛋白，避免修饰丢失；随后使用Lys-C或胰蛋白酶酶切蛋白，同时优化条件以提高Kcr肽覆盖率；然后通过高特异性抗-Kcr抗体进行免疫富集，提高质谱检测灵敏度；在LC-MS/MS分析中使用高分辨率Orbitrap质谱结合纳升级液相色谱，设置动态巴豆酰修饰搜索以识别和定量肽段；最后通过MaxQuant或Proteome Discoverer进行修饰定位、定量和差异分析，并结合生物信息学进行通路和功能注释。百泰派克生物科技在此流程中提供从样本处理到高覆盖Kcr谱图的全流程技术支持，能够帮助科研人员高效、可靠地解析组蛋白巴豆酰化在基因调控与代谢状态中的作用。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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