过度能量饮食摄入是代谢综合征(MetS) 发生的风险因素之一，能量摄入过多会改变男性生殖功能，导致精子发生异常，引发男性不育症发病率的增加。肠道菌群在代谢紊乱中起着关键作用，肠道微生物群对精子发生异常有着重要影响。内蒙古大学张滕研究员团队建立了代谢综合征(MetS)绵羊模型，对睾丸标本、宿主代谢组和肠道微生物进行分析，结合粪便微生物群移植证实了肠道微生物群与精子发生异常之间的联系，从而探讨精子发生受损的肠-睾丸轴机制。
过量能量饮食引起的代谢紊乱导致精子发生障碍
本实验设置正常饮食组（ND），中能量饮食组（MED）、高能量饮食组（HED），其中MED组和HED组体重显著增加、胰岛素抵抗、血清低密度脂蛋白和总胆固醇显著升高，表明两组动物具有代谢综合征表型。睾丸切片H&E染色结果表明过量能量摄入诱导精子发生受损。10×scRNA测序分析表明，精子发生障碍是由于精原细胞(SPG)分化受阻所致。为了阐明代谢紊乱引起的精子发生障碍中生殖细胞分化的分子性质，使用ND、MED和HED组的生殖细胞，计算各细胞亚型百分比精原细胞（SPG）(ND: 3.8%， MED: 6.58%，HED: 14.28%)、早期精母细胞(ND: 7.86%, MED: 17.60%, HED: 22.99%)和晚期圆形精细胞(ND: 41.00%, MED: 16.12%, HED: 14.36%)在三组间具有统计学差异（图1E-F）。与H&E染色结果相对应，MED和HED组生精细胞显著降低，提示SPG分化中断。采用GO分析探讨MetS绵羊模型中SPG分化迟缓的机制，在ND与MED和ND与HED中生殖调控通路和代谢调控通路高度富集。
（图1）
MetS模型中胆汁酸的急剧下降破坏维生素A的吸收
为了探讨SPG 分化受阻是否与肠道代谢相关，对肠道内容物进行非靶向代谢组检测分析。过量能量饮食足以引发代谢产物的改变，在两个对比组中有250种共同的差异代谢物发生改变，它们主要富集在维生素消化吸收通路中(图2B)。维生素消化吸收途径中富含的差异代谢产物由三种脂溶性维生素和五种水溶性维生素组成(图2C)。由于胆汁酸相关途径也被富集，由此推测脂溶性维生素的吸收受胆汁酸水平影响。这三种脂溶性维生素为视黄醇、视黄素和α-生育酚（维生素E）。视黄醇和视黄素是维生素A的生物活性形式，它们在体内可以相互转化，具有相同的功能。视黄素可能进一步氧化为视黄酸，但这是一个不可逆过程。而维生素E是一种抗氧化剂，能促进维生素A吸收。数据分析结果显示，与ND组相比，MED和HED组中维生素E 的相对丰度降低（图2Da），说明两组中维生素A的吸收受到影响。而与ND组相比，MED和HED组中视黄醇相对丰度显著增加，视黄素相对丰度显著降低（图2Db-c）。表明很少有视黄醇转化为视黄素，而视黄醇没有被吸收就可能流失了。此外，甘胆酸的相对丰度没有发生变化，而胆酸(CA)、石胆酸(LCA)和牛磺酸去氧胆酸(TUDCA)相对丰度显著降低(图2Dd-g)。综上，代谢组学结果提示在MetS模型中胆汁酸水平的降低会影响维生素A的吸收。
（图2）
MetS模型诱导肠道菌群失调
对肠道内容物进行16S rDNA测序，与ND组相比，MED组和HED组29个细菌在属水平上发生了改变，其中Ruminococcus_2 和 Ruminococcaceae_NK4A214_group 的相对丰度以能量剂量依赖性方式显著降低。胆汁酸可以促进脂溶性维生素A的吸收， Pearsons相关分析发现CA、LCA和TUDCA与视黄醇和视黄素相关（图3），Spearman分析发现Ruminococcaceae_NK4A214_group与CA、LCA和TUDCA存在显著相关, 推测Ruminococcaceae_NK4A214_group显著下调，进而对MetS模型中胆汁酸水平产生影响，从而影响宿主维生素A吸收。
（图3）
MetS模型中维生素A代谢紊乱通过血液循环转移到宿主睾丸
为了研究精子发生异常的机制，采用LC-MS靶向代谢组学分析不同处理组睾丸样本中维生素A水平，与ND组相比，HED组维生素A水平显著降低，血清中维生素A水平变化趋势一致。睾丸细胞从血液中吸收维生素A，血清维生素A与视黄醇结合蛋白4（RBP4）结合，维生素A通过RBP4输送进入睾丸细胞。采用免疫荧光(IF)染色和Western blot检测RBP4表达水平，与ND组相比，MED和HED组RBP4表达水平显著降低（图4C）。这与睾丸组织和血清中维生素A水平变化一致。此外，检测了减数分裂前细线期精母细胞（pre-L-SPC）标记基因的表达(图4D-F)，发现pre-L-SPC阶段STRA8和SYCP3表达水平显著下降。在本研究中，精子发生过程损伤是由减数分裂基因标记表达下调引起，维生素A代谢在减数分裂基因激活中起着至关重要的作用。使用IF染色和Western blot检测睾丸中RDH10表达水平，发现与ND组相比，RDH10在MED和HED组中下调。综上，表明维生素A和RDH10水平的降低导致MetS模型中睾丸精子发生受损。
（图4）
维生素A代谢紊乱导致精子形成受损依赖于肠道菌群
为研究肠道微生物群对MetS模型中精子发生受损表型的影响，将ND组和HED组的肠道内容物通过灌胃方式移植到小鼠体内，定植8周后与ND-FMT组小鼠相比，HED-FMT组小鼠睾丸维生素A水平显著降低（图5B）。与ND组相比，HED组和HED-FMT组的Ruminococcaceae_NK4A214_group的丰度显著降低。H&E 染色检查睾丸形态，发现移植了ND微生物群的小鼠睾丸发育正常，而移植了HED组菌群的小鼠睾丸组织表现出生精上皮变薄和睾丸细胞从生精小管基底膜上脱落，且部分生精细胞死亡并脱落到小管腔中（图5D）。通过IF染色和Western blot(图5F-H)检测STRA8和RDH10的表达水平，发现HED-FMT蛋白表达明显下降，与MetS结果相似。综上结果表明，菌群移植受体小鼠重现了代谢紊乱模型中观察到的微生物和代谢表型，肠道微生物群介导了维生素A代谢紊乱，导致精子发生破坏。
（图5）
小结
代谢综合征中男性不育通常伴有肠道微生物菌群失调，因此，肠-睾丸轴在代谢综合征男性不育的病因学中值得深入探讨。本文对过度能量饮食诱导的MetS模型中精子发生受损进行了详细的表型评估，发现异常小管的数量显著增加，SPG分化急剧下降。在MetS模型中观察到肠道对维生素A吸收受到破坏，主要是由于在MetS模型中肠道微生物群的不平衡导致胆汁酸丰度显著减少，脂溶性维生素的吸收受到胆汁酸水平降低的影响，维生素A的代谢异常通过循环血液转移到睾丸细胞，导致精子发生受损。通过粪便微生物群移植实验证实异常的维生素A代谢依赖于肠道微生物群，从而导致精子发生受损。本研究揭示了维生素A在肠道-睾丸轴代谢中的关键作用，通过恢复维生素A代谢相关的肠道菌群将对MetS引起的男性不育患者的治疗具有潜在价值。
（图6）
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参考文献
Zhang T, Peng S, et al. Disrupted spermatogenesis in a metabolic syndrome model: the role of vitamin A metabolism in the gut–testis axis. Gut. 2022.
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