肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的第三大原因。由于缺乏早期诊断标志物，大多数HCC患者往往在确诊时已处于晚期，预后较差。门静脉系统的环境可能在HCC的发展中起重要作用。越来越多的证据表明，代谢物对HCC的形成很重要。然而，由于门静脉血的可及性较差。因此，比较HCC患者与健康受试者在门静脉、中央静脉、肝组织和粪便样本中的代谢变化，更有助于深入了解肠-肝轴进而评估HCC患者的潜在病因和新的治疗靶点。来自香港中文大学的于君团队等对HCC患者和健康肝脏供体的血清、肝脏和粪便样本进行综合代谢组学分析，以揭示HCC患者以前未报道的代谢改变，相关研究成果发表于《Gut》。
1. HCC患者和健康对照的队列设计及特征
招募两个独立的HCC患者和健康肝脏供体队列，采用严格的纳入和排除标准，以避免对菌群或菌群代谢物的影响。建立两个研究队列来探索代谢改变和HCC之间的关联。其中，发现队列包括52例HCC患者和50例健康对照，验证队列包括50例HCC患者和50例健康对照。在发现和验证队列中，慢性乙型肝炎病毒感染是HCC的主要原因，分别占65.4%和60%。与健康对照组相比，HCC患者年龄较大，血清丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶 (AST)、γ-谷氨酰转肽酶 (GGT)、碱性磷酸酶 (ALP)、直接胆红素和凝血酶原时间 (PT) 水平较高。但总蛋白、白蛋白和血小板水平较低。对来自HCC患者的门静脉和中央静脉血清、癌组织及癌旁组织和粪便样本（3种样本类型共360个样本）以及来自正常受试者的门静脉和中央静脉血清、肝组织和粪便样本（3种样本类型共300个样本）共660个样本通过液相色谱串联质谱（LC-MS）平台进行代谢组学检测，根据血清、组织和粪便的代谢物变化进行综合分析，并在肝细胞系中验证候选代谢物的功能（图 1）。
图1. 代谢组学和生物验证研究流程
2. 与健康对照相比，在HCC患者中发现了代谢改变
在所有收集的样品中共检测到2799种代谢物，包括在发现队列中，鉴定到156种(ESI–)和285种(ESI+)血清代谢物；305种(ESI–) 和535种(ESI+) 肝组织代谢物；440种(ESI–)和703种(ESI+) 粪便代谢物；在验证队列中，鉴定到146种(ESI–)和229种(ESI+)血清代谢物。PLS-DA分析结果显示，HCC患者与对照组个体具有不同的代谢物簇。通过拟合PLS-DA建立了一个包含代谢组学信息的模型，并通过200次随机排列测试其在七次交叉验证期间正确分类新样本的能力。拟合优度（R2）和预测优度（Q2）的截距说明PLS-DA模型是可靠的，并且没有过度拟合。考虑到统计学上的显着差异（p 值）和投影中的变量重要性（VIP），绘制了HCC患者中已识别代谢物水平相对于健康对照的倍数变化的火山图，结果显示在门静脉血清、中央静脉血清、HCC肝组织和粪便样本中，与相应的对照组相比，HCC患者的差异代谢物水平发生显著改变。总之，HCC与门静脉、中央静脉、肝组织和粪便样本等多种来源的代谢组的显著变化有关（图2）。
图2. 在3种样本类型中均发现 HCC 的代谢改变
3. HCC患者从门静脉血清到中央静脉血清的代谢发生变化
评估门静脉和中央静脉之间代谢物的相对变化，作为通过肝脏后变化的反映。比较从门静脉到中央静脉的代谢物在HCC患者和健康对照的差异。结果显示，在HCC患者中发现17种代谢物，在正常对照组中发现12种代谢物，在两种ESI模式中，从门静脉到中心静脉的减少变化为两倍或更多。总之，门静脉代谢改变不同于外周血代谢改变。门静脉结果将为HCC发展过程中的代谢组学改变提供更多的见解(图3)。
图3. HCC 患者和健康对照组从门静脉到中央静脉的代谢物显著降低
4. HCC患者门静脉血清中的致病代谢物升高
为了揭示可能参与HCC形成的代谢表型，通过层次聚类分析比较从门静脉到中央静脉血清样本的代谢变化。发现与HCC中的中央静脉相比，门静脉中有56种代谢物显著升高，在ESI–和ESI+模型中分别鉴定到28种。而且，HCC 患者门静脉中鉴定出的这56种升高的代谢物也显著高于健康对照。此外，这些升高的代谢物在独立队列中得到验证，与健康对照相比，其中25种在 HCC 患者的门静脉血清中也升高。
进行KEGG通路富集分析，并在ESI–和ESI+模型中确定显著的富集通路，结果显示，初级胆汁酸生物合成、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及苯丙氨酸和色氨酸代谢是HCC患者门静脉代谢物中发生改变的主要通路。已报道，这些通路相关的代谢物有助于全身性肝脏炎症。其中，L-色氨酸是一种重要的癌症营养物质，去除它会导致肿瘤的破坏。使用HCC细胞系 Hep3B、Huh7和正常肝细胞细胞系MIHA对升高的门静脉代谢物（如 L-色氨酸）进行功能验证，结果显示，L-色氨酸显著促进HCC细胞（Hep3B 和 Huh7）中的细胞增殖，但在MIHA中不以时间依赖性方式促进细胞增殖。总之，门静脉中升高的代谢物可能有助于HCC 的肿瘤发生（图4）。
图4. HCC患者门静脉致病代谢物
5. HCC肿瘤组织中代谢物升高
与HCC患者的癌旁组织相比，在癌组织中鉴定出116种升高的代谢物，其中43种在ESI–模型中和73种在ESI+模型中被鉴定到。而且，与健康对照相比，116种升高的代谢物在HCC患者的肿瘤组织中也显著更高。其中，与正常肝组织相比，HCC肿瘤组织中DL-3-苯基乳酸、L-色氨酸、甘氨胆酸和1-甲基烟酰胺的门静脉代谢物也显著升高。将这些代谢物的水平与肝功能的生化指标进行相关性分析，结果显示，DL-3-苯基乳酸、甘氨胆酸和1-甲基烟酰胺与血清AST、ALT、ALP、GGT、血清总胆红素和PT水平呈正相关，与血清白蛋白和血小板水平呈负相关，表明HCC患者门静脉和肿瘤组织中代谢物升高与肝功能受损有关。
随后根据这4个代谢物的浓度中位值将HCC患者分为高与低类别。当根据单个代谢物的中位值对队列进行二分位时，DL-3-苯乳酸的总体死亡率危险比为3.975，L-色氨酸为 3.662 ，甘胆酸为 3.975，1-甲基烟酰胺为 3.487，表明HCC患者门静脉和肿瘤组织中升高的代谢物与生存率降低有关（图 5）。
图5. 验证HCC肿瘤组织中的致病代谢物
6. HCC患者门静脉中降低的代谢物在体外对 HCC 具有保护作用
最后，评估HCC患者门静脉样本中降低的代谢物，并与相同患者粪便样本中降低的代谢物的交集情况，结果显示，与发现队列中的健康对照相比，亚油酸和苯酚在 HCC 患者的门静脉血清和粪便样本中均显著减少，并在验证队列中的 HCC 患者的门静脉血清样本中得到证实。对HCC 细胞系中亚油酸和苯酚进行功能研究，结果显示，亚油酸和苯酚均以时间依赖性方式显著抑制HCC细胞系Hep3B和Huh7中的细胞增殖，但不抑制正常肝细胞系MIHA的细胞增殖；同时，还发现亚油酸和苯酚显著抑制 HCC细胞系Hep3B和Huh7的集落形成；此外，亚油酸和苯酚增加HCC 细胞的凋亡。总之，亚油酸和苯酚抑制细胞增殖并诱导 HCC 细胞凋亡，推断它们的抗 HCC 功能是保护性代谢物（图 6）。
图6. 体外HCC潜在保护性代谢物的验证
小结
本研究招募发现队列和验证队列，收集HCC患者和健康对照的血清（门静脉和中央静脉）、肝脏组织和粪便样本进行了深入的综合代谢组学分析。阐述了HCC 患者先前未报告的代谢改变。在门静脉（肠道和肝脏之间的关键体液通讯途径）中，确定了升高的致病性代谢物和降低的保护性代谢物，表明它们在HCC发展中的关键作用。
参考文献
Integrative metabolomic characterisation identifies altered portal vein serum metabolome contributing to human hepatocellular carcinoma. Gut. 2021. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325189.
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